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关于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生物活性及杀伤效应的检测方法

作者:香雪生命科学研究中心-刘敏

发布时间:2019-06-21

阅读:337

 

       肿瘤免疫学是生命科学领域发展极为迅速的一个分支,其研究内容涉及:肿瘤抗原及其免疫原性;肿瘤发生、发展与免疫的关系;应用免疫学原理和方法对肿瘤进行诊断、治疗和预防。近年来,肿瘤免疫治疗的研究也取得了很大的进展,在这些研究中CTL的定性和定量检测非常重要,因此如何更好地检测CTL的生物活性及杀伤效应成为一个关键的问题。故许多新的评估CTL活性的方法也同时得到发展,本文就此进行综述。

 

1.     酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)

 

      ELISA是一种基于酶的免疫测定方法,由于酶标的放大作用,利用酶标记抗体的免疫检测,因其高特异性和敏感性而日益受到人们的青睐。

 

      细胞因子夹心ELISA是一种敏感的酶免疫分析方法,可以特异性地检测和定量可溶性细胞因子和趋化因子蛋白的浓度。这一方法的基本原理是:①将已知抗体结合到某种固相载体表面;②加待测抗原,如两者是特异的,则发生结合,然后把多余抗体洗除;③加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体,使形成“夹心”;④加入该酶的底物,若看到有色的酶解产物产生,说明在孔壁上存在相应的抗原,利用酶标仪测其OD值。有色产物的量与待测抗原的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

 

      其局限性:①ELISA数据不能提供单个细胞产生因子的能力和频率;②因受刺激细胞群的细胞因子产生是短暂的,并且不同细胞因子基因的表达动力学可以变化,故可能需要在几个时间点收集测试样品以更好地表征实验动物或培养细胞群的细胞因子产生。③在任何一个时间点测量的细胞因子蛋白浓度可能反映细胞因子分泌,细胞因子摄取的并发过程。通过细胞和细胞因子蛋白降解。由于这些过程,测量的细胞因子蛋白水平可能显著低估细胞的实际细胞因子产生潜力。④试剂不统一,标准不统一,故定量不准确等。

 

2.     酶联免疫斑点法(ELISPOT)

 

      ELISPOT是检测和计数体外分泌特定蛋白质的单个细胞的有力工具。该方法可通过检测某些细胞因子的分泌水平评估抗原免疫后机体的细胞免疫应答能力,具有较高的敏感性和高效性。其基本原理是:①细胞受到刺激后局部产生细胞因子,此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。②被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合,其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。③底物孵育后,PVDF孔板出现“紫红色”的斑点表明细胞产生了细胞因子,通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。

 

      ELISPOT法源自ELISA,又突破传统ELISA法,是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白,它们最大的不同在于:ELISA通过显色反应,在酶标仪上测定吸光度,与标准曲线比较得出定量的可溶性蛋白总量。ELISPOT通过显色反应,在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点,可直接通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数,从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率。由于是单细胞水平检测,需细胞量少, 比ELISA更灵敏。捕获抗体为高亲和力、高特异性、低内毒素单抗,在研究者以刺激剂激活细胞时,不会影响活化细胞分泌细胞因子。但该方法对于操作者的技术要求较高,要保证孔中细胞的均匀性,否则读板误差会很大。

3.     51Cr释放法

 

      51Cr释放法创建于1960年,是测定细胞杀伤功能最经典的方法,其原理为:铬酸钠(Na251CrO4)能进入到增殖的细胞内,与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记的51Cr细胞受到损伤或死亡之后,即可释放出51Cr。51Cr辐射γ射线,通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中的51Cr,即可计算出细胞的杀伤能力。但其有很多不足:①51Cr有放射性,不利于安全操作,且自释放较高;②51Cr半衰期短,不能进行多次测定;③定性分析,无法定量④不能在单细胞水平测定等。

 

4.     LDH释放法

 

       LDH释放法是基于比色法的检测方法。乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一,在正常情况下,不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时,细胞膜通透性改变,LDH可释放至介质中,所以细胞死亡数量与细胞培养上清中LDH活性成正比。其原理为:释放出的LDH在培养基上清中,可通过 30分钟偶联的酶反应来检测,在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。利用酶标仪测其OD值,经过计算即可得出细胞活性。此方法的缺点是效应细胞作用于靶细胞后会有不同程度的细胞损伤,进而释放LDH,LDH可能存在部分自发释放现象,都会影响到细胞活性毒性检测,故其对细胞状态要求较高。

 

5.     基因转染法

 

       应用基因转染技术将原核或真核生物的报告酶如β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)或荧光素酶(luciferase, luc)基因转染靶细胞,建立稳定转染靶细胞系, 以此测定CTL介导的细胞毒和细胞凋亡。通过测定释放入培养液中报告酶活性(代表靶细胞死亡数目), 便可计算出效应细胞杀伤靶细胞百分率。在实验中因β-gal半衰期较luc长, 故实际应用较多。本法优点在于:①灵敏度高, 自发释放背景低;②用不同报告基因转染的细胞系可同时测定杀伤效应, 结果互不干扰;③用不同的基因调控元件(如组织特异性的或活性可诱导的启动子)控制报告基因的表达,可进一步进行深入机制研究。其主要不足是建立报告基因稳定转染细胞系费时费力,报告基因在有些靶细胞中难以转染或表达。

 

6.     荧光测定法

 

       荧光测定法 如Alamar-Blue一步荧光测定法、Calcein-am荧光扫描测定法等。这些测定所基于的原理都与51Cr释放实验基本相同,即将标记物质渗入到靶细胞内, CTL杀伤靶细胞后, 检测这些物质释放到培养基内的水平。虽然随着荧光测定仪器的普及和新的荧光标记物的发现,荧光测定法将有可能取代传统的51Cr释放法, 但由于荧光测定法基于的原理近似于51Cr释放法, 所以都不能从本质上解决不同靶细胞标记效率不同、CTL杀伤活性的检测不够敏感等问题

 

7.     IncuCyte

 

      以上介绍的所有检测方法都采用的是传统的终点法,这种方法无法对CTL杀伤过程进行实时的监测并进行定量分析。美国Essen公司开发了一款非标记的,长时间动态活细胞成像分析仪(IncuCyte)。 这一分析仪能实现对CTL杀伤过程进行实时的监测并进行定量分析。其原理与用的染料有关,总体分为两种:一种为活细胞染料,一种为死细胞染料。

 

      目前常用的活细胞染料有IncuCyte NucLight(一种细胞渗透性DNA染料,专一性染活细胞的细胞核,当加入组织培养基后,该惰性染料穿过细胞膜,特异性染色DNA,然后就可用活细胞成像方法监控IncuCyte NucLight特异性染色DNA荧光的变化,发生实时活化的图像,用IncuCyte分析仪进行定量。)

 

      死细胞染料有IncuCyte Caspase-3/7(将活化的caspase-3/7识别部位(DEVD)和一种DNA嵌入染料NucView 633相偶联,当该试剂加入组织培养基后,这种惰性的,无荧光的底物穿过细胞膜,在膜上被活化的caspase-3/7切开,释放出DNA染料,将细胞核里的DNA染上荧光。然后就可用活细胞成像方法监控caspase-3/7发生实时活化的图像,用IncuCyte分析仪进行定量。)IncuCyte Annexin V(一种高度选择性的磷脂酰丝氨酸(PS)花箐荧光染料,当细胞发生凋亡时,细胞质膜的磷脂酰丝氨酸(PS)的不对称性消失,PS显露在细胞外表面,该试剂就与之相结合,发出明亮的光稳定的荧光信号。应用IncuCyte内置的分析软件,可以定量发出荧光的凋亡细胞,也可以最小化背景荧光值。)YOYO-3,IncuCyte细胞毒性试剂等

 

      其优点是:①培养的细胞用显微镜直接监测,为非破坏性的监测;②监测过程中细胞无需离开培养箱,不用担心培养条件的改变对细胞状态的影响;③可在实验室外对细胞进行长时间监测等。此方法也存在不可忽视的弊端,即不同的靶细胞生长速度及形态大小不同,若要同时进行多种靶细胞的检测,便需要对所检测靶细胞进行预实验,从而选出最佳种板靶细胞数。

 

      以上介绍的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生物活性及杀伤效应的检测方法应该是目前比较成熟且应用较多的技术。还有很多检测方法在这里没有介绍的,如流式细胞术及基于物理压力原理的检测仪器等,如果有兴趣可自行查阅。

 

 

 

 

 

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