近年来，液质联用技术在生物大分子研究上得到了广泛的应用，成为蛋白质组学研究的支撑技术之一。我们香雪生命科学研究中心目前就拥有两套先进的液质联用系统，分别是Eksigent NanoLC与SCIEX Triple TOF 5600+联用、DIONEX NanoLC U3000与Thermo Q-Exactive Plus联用，这两套液质系统在TCR-T细胞治疗的研发过程中发挥着举足轻重的作用，它们帮助我们发现了大量的文献报导过或未报导过的抗原肽，为TCR-T细胞治疗的研发提供了丰富的靶点；另一方面，这两套液质系统如同研究者的眼睛，对样品进行精准的分析，为TCR-T细胞治疗的研发提供了质量保障。

 

 

图1 香雪生命科学实验室的两套液质联用系统

 

       但是你知道它们是怎么工作的吗？现在让我们一起来学习液质联用技术的基本原理。

 

       液质联用，顾名思义就是液相色谱（LC）和质谱（MS）的联用，液相色谱将待测样品中的有机物成分有效分离，质谱负责对这些分开的有机物进行检测鉴定，两者的有效结合能够对复杂样品进行准确的定性和定量分析。举个例子，样品相当于广场上成千上万的人群，色谱把人群按照一定的规则（比如按身高或年龄之类）排成队伍走出广场，质谱在广场出口对人员信息进行一一识别，这样就可以准确地收集大量人员的信息。

 

一、液相色谱

 

1.1液相色谱的基本原理

 

       首先我们来认识一下色谱。1906年，俄国的植物学家Tsweet利用碳酸钙作为基质，石油醚作为流动相成功分离了叶绿素和胡萝卜素。它们分离后呈现出不同颜色的条带，因此Tsweet把这种分离技术取名为色谱。这里色素的分离就是利用了柱子上的碳酸钙对色素的吸附作用力强弱不同，导致色素在柱子里的流动速度也不一样，从而达到分离的效果。所以，色谱分离的原理就是利用待分离物质在固定相（比如前面提到的碳酸钙）和流动相（比如用来冲洗色素的石油醚）之间相互作用的差异来实现物质的分离。

 

      高效液相色谱是以经典的液相色谱为基础，由分离系统、流动相输送系统、进样系统、检测系统等几个模块构成。以液体为流动相，采用高压输液系统将单一溶剂或不同比例的混合溶剂等流动相泵入装有固定相的色谱柱，各成分在柱内被分离后，进入检测器进行检测。相对Tsweet的色谱分离模型，高效液相色谱具有更高的分离效率和灵敏度，自动化高，重现性好。

 

1.2 纳升级液相色谱

 

        对于微量且复杂的蛋白质分析，高效液相色谱的灵敏度还不够，目前常用纳升级液相色谱（Nano-LC），比如我们香雪生命科学实验室中的Eksigent NanoLC和DIONEX NanoLC U3000。纳升级液相色谱主要以缩小色谱柱内径和降低流速来提高检测的灵敏度。以常规高效液相色谱常用的4.6mm内径的色谱柱和1mL/min的流速为例来对比，纳升级液相色谱如使用75μm内径色谱柱、300nL/min的流速，相当于色谱柱内径缩小了约61倍，流速降低了约3300倍。这意味着进相同样品量，纳升级液相色谱中样品被流动相稀释后的理论浓度是常规高效液相色谱的约3000倍，从而提高了检测的灵敏度。相应地，纳升级液相色谱要求样品应浓缩到相对小的体积再进样，但这不易实现。目前纳升级液相色谱普遍采用增加Trap柱系统的方法，样品先进入Trap柱富集肽段，用高水相和高流速（2-5μL/min）冲洗，除去样品中的盐和其它杂质后，再将Trap柱与分析柱相连，样品经流动相洗脱进入分析柱。样品经过分析柱后就可以引入到质谱检测。

 

二、质谱

 

       顾名思义，质谱仪就是检测质量的仪器，将待测样品分子离子化形成带电离子，利用电场或磁场将运动的离子按质荷比（m/z）分离并被检测。我们可以根据各离子的质荷比及其相对强度来鉴定化合物分子组成和相对浓度。

 

       既然是根据离子的质量来推测化合物分子组成，不得不先认识评估质谱的两个重要参数：分辨率和准确度。分辨率：是指质谱仪区分两个质量相近的离子的能力。准确度：指质谱仪对指定质量数离子测量值与理论值之间的偏差，单位ppm。分辨率越高，质量偏差越小，理论化合物范围也越窄，可大大提高鉴定的准确度。目前高分辨质谱仪准确度可达到2-5ppm。

 

2.1质谱的基本构成

 

       接着，我们来认识一下质谱的构成。质谱大体构造是基本相同的，主要分成以下几个部分：真空系统、离子源、质量分析器、检测器及数据处理系统。

 

 

图2 质谱构成的示意图

 

       真空系统：质谱为什么需要真空系统？假设没有真空，离子碎片经过质量分析器时，可能会碰到氧气、氮气等气体分子，它的运行轨道就会发生变化，还可能失去电荷。所以，需要保证质谱的真空状态，为离子提供一个足够长的无碰撞运行轨道。

 

       离子源：主要作用是将液相的化合物分子气化电离成带电荷的离子，因为只有带电荷的离子才可以在质谱仪的场中运动，是衔接色谱与质谱的关键。电喷雾离子源可形成多电荷离子，适合分析蛋白质、肽等生物大分子。离子化过程简单归纳为：高压电场作用下，液体样品流至喷嘴时形成泰勒锥，产生带电荷的微液滴，液滴上的溶剂蒸发，表面电荷密度过大，使液滴分裂成更小液滴，多次分裂后形成气态离子。

 

      质量分析器和检测器：质量分析器是质谱的核心模块，利用电场和磁场将带电荷的离子按质荷比m/z的大小分开，下面会具体介绍；检测器对分离后的离子及其强度进行读取。

 

2.2 质量分析器的类型及基本原理

 

       目前常用的质量分析器按分离方式主要有四极杆（Quadrupole，Q）、飞行时间（TOF）、离子阱（ion trap）、轨道阱（Orbitrap）等。

 

       四极杆：四极杆分析器是由四根导电杆组成，四个杆分别位于正方形的四个角。质谱仪通过在四级杆施加RF和DC电压来控制离子的运动，通过电压的变化，四级杆形成的电场可以让不同质荷比的离子通过。四级杆具有过滤离子的功能。四极杆分析器分辨率较低，准确度不高，但稳定性好，定量能力强。

 

     飞行时间（TOF）：飞行时间分析器像一个离子漂移管。由离子源产生的离子先被收集，收集器中所有离子速度变为0。离子经过电场加速区域获得相同的初始动能后，进入没有电场区域以恒定的速度飞向离子接收器。由于所有离子的初始动能相同，重的离子飞行速度慢一些，轻的离子飞得快，不同m/z的离子到达检测器的时间不同，根据时间来计算离子的质荷比。TOF具有最快的扫描速度和最宽的分子量检测范围。

 

 

图3 四类质量分析器示意图

 

离子阱（ion trap）：线性离子阱分析器横截面比较类似于四极杆，在电流电压下可使离子一直保持在离子阱中心运动，通过调节电流电压，特定离子会被弹射出来用于后续的碎裂和质量分析。离子阱同样具备特定离子的选择过滤功能。离子阱适合于分子结构方面的定性研究，能够给出分子局部的结构信息。

 

轨道阱（Orbitrap）：轨道阱分析器由一对外半电极围绕的纺锤形中心电极组成。运动的离子被静电场捕获，在静电引力和离心力双重作用下，离子围绕中心纺锤形电极做螺旋模式运动，不同质荷比的离子以不同的频率振荡，通过傅立叶变换转化读取离子的m/z信息。Orbitrap具有较高的分辨率。

 

 

       根据分离原理和作用的不同，可以将上面的质量分析器分为两大类：一类为质量检测型，可测定进入质谱仪的不同质荷比离子的丰度，但不能选择离子通过质谱仪，比如TOF和Orbitrap等；另外一类是质量过滤型，可让特定质荷比或质荷比区段的离子通过质谱仪，比如四级杆和离子阱。

 

2.3串联质谱

 

        液质联用主要采用软电离的离子化方式，通常很少或没有碎片，如果只采用单个质量分析器，谱图中只有准分子离子，只能提供未知化合物的分子量信息，不能提供更多结构信息，未能体现较好的鉴定能力。为了解决这方面的问题，通常利用串联质谱来实现这个需求。

 

       目前最常用的串联质谱是三重四级杆（Triple Quadrupole），在两个四级杆间加一个碰撞池进行串联。它在保留原有定量能力强的特点上，串联功能加强了质谱的定性能力和检测灵敏度。三重四级杆灵敏度高、特异性强，适用于小分子检测，在食品、环保、制药和司法鉴定领域应用成熟，在临床诊断的生化、免疫、分子等领域对传统方法学正在进行替代。

 

       蛋白质组学分析具有成分复杂且含量低的特点，采用质量过滤型分析器与高分辨率质量分析器串联的方法比较常见。比如我们香雪生命科学实验室的SCIEX Triple TOF 5600+采用了四级杆和TOF串联串联，Thermo Q-Exactive Plus采用四级杆和Orbitrap组合。它们的串联方式与三重四级杆类似：四级杆+碰撞室+TOF或者Orbitrap。

 

 

图4 Thermo Q-Exactive Plus的结构示意图

 

        质谱的串联方式有很多，但无论哪种串联，都必须有碰撞活化室，二级谱图检测过程大致如图所示：从第一级MS选定的特定质荷比离子，经过碰撞诱导裂解形成一些碎片，再经过第二级MS进行质量分析，获得碎片离子峰。通过对碎片的化学结构进行分析和拼装，来实现对化合物的结构鉴定。

 

 

图5 串联质谱示意图

 

       具体到对肽段序列的检测分析，肽段在质谱中的碎裂有一定的规律，肽段母离子在质谱仪的碰撞室经高流速气体碰撞诱导解离，其中以肽链在肽键中间裂解形成的b型和y型子离子在质谱图中丰度较高。b型离子保留肽链N端，y型离子离子保留肽链C端。y、b系列相邻离子的质量差，即为氨基酸残基质量，根据完整或互补的b、y系列离子可推算出肽段的序列。

 

       经过上面分别对液相色谱和质谱的简单介绍，您对液质联用技术有了初步的认识了吧？

 

参考文献：

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[3]何华勤. 简明蛋白质组学[M]. 北京:中国林业出版社, 2011:76-97

[4]王勇为.确证定量分析新工具-Thermo Scientific Q Exactive台式四极杆-轨道阱高分辨质谱仪[J].现代科学仪器, 2011(005):138-140