质谱(massspeetrometr，MS)技术是蛋白质组学和生物大分子研究领域里的重要工具[1]。质谱不仅可以精确得到蛋白质的分子量，而且可以直接进行测序。质谱高效、不受末端是否封闭及是否经过翻译后修饰等的限制，随着分离技术的发展，液相质谱串联技术不断提高，高通量分析抗原表位成为可能，因此在抗原表位研究中应用越来越多。

 

一 质谱技术的原理

 

       质谱是一种将化学物质发生离子化后，通过离子的质荷比来分析的技术。质谱组成主要包括进样系统、离子源、质量分析器、检测器以及分析系统。上世纪八十年代，液相串联质谱技术已经解决了蛋白质等生物大分子同分异构体的问题，同时提高大分子化合物的离子化效率。随着纳升流量技术的引入，使离子源的流速达到纳升/分钟，解决因样品含量少而无法检测的问题，同时也提高了检测灵敏度和检测限（飞摩尔/微升）。复合式质谱即是把两种不同的质量分析器串联起来使用，也就是MS/MS系统，例如：Q-TOF和QE等，它具有高灵敏度的优点。第一个质量分析器进行母离子的选择，第二个质量分析器进行片段化碎裂后的子离子选择。适合肿瘤细胞中MHC-I递呈肽这类极少量的样品来获得高质量的谱图。

 

二 质谱在氨基酸测序的应用

 

       在鉴定新的肽和蛋白质、合成蛋白及从蛋白质酶解液中分离出的肽时，准确确定氨基酸序列的信息是非常重要。而质谱技术已成为氨基酸测序的有效工具。在ESI/MS中，首先在一级质谱得到目标肽的分子离子，然后选取目标肽的离子作为母离子，与氩气或者氦气发生碰撞，使肽链中的肽键发生断裂，形成一系列子离子，即N端碎片离子系列(b系列)和C端碎片离子系列(y系列)，对碎片离子系列综合分析并给予评分，最终得到肽段的氨基酸序列。由于亮氨酸与异亮氨酸分子量相同，无法区分。Ramsey等通过负离子质谱跟踪由亮氨酸和异亮氨酸衍生出的乙内酰苯基硫脲的[M-H]-离子，根据亮氨酸主要显示丙基的丢失，而异亮氨酸衍生物则显示甲基和乙基的丢失这一特性，成功区别肽链中亮氨酸和异亮氨酸。

 

三 质谱法在抗原表位研究中的应用

 

       近代免疫学研究发现,一个病原体起免疫功能的主要是抗原蛋白，其中起决定作用的又是抗原蛋白上的抗原决定簇，即抗原表位。抗原表位可以分为T细胞表位和B细胞表位。T细胞表位是抗原经过抗原递呈细胞加工后，由HLA分子递呈给T细胞抗原受体TCR的短肽。抗体识别的抗原决定簇称为B细胞表位。T细胞表位又可分为内源性抗原细胞表位和外源性抗原细胞表位。内源性抗原细胞表位来源于胞内抗原,与HLA-I类分子结合,运送到细胞膜上，再与CDS+T细胞上TCR结合，介导T细胞免疫应答。而外源性抗原T细胞表位多来自于细胞外抗原，先结合到HLA-H类分子凹槽中,然后再运送到膜上，由HLA-H类分子递呈给CD4-Th细胞，激活Th细胞辅助B细胞产生抗体，并介导NK细胞等免疫细胞产生细胞免疫应答[2]。质谱法在上述抗原表位研究中均有重要应用。

 

       1992年，质谱首次被应用于HLA-I类分子表位研究，Hunt等[3]通过酸洗方法在转染了HLA-A2分子的人淋巴母细胞系CIR-A2.1中分离出抗原表位，使用毛细管电泳色谱串联质谱(NanoLC-MS/MS)，准确鉴定抗原肽的分子量以及氨基酸序列。由于CIR细胞系自身是不会不表达HLA类分子，因此，从转染了HLA-2A分子的CIR-A2.1中分离的抗原肽均为HLA-A2递呈的抗原肽。

 

       随着人们对于Th细胞功能认识的不断深化，HLA-II类分子递呈的抗原肽研究越来越被人们重视。Chicz等[4]将质谱技术应用于II类表位研究，成功地分离出25个HLA-DRI递呈的抗原肽，以及得到5条抗原肽的准确序列，其中有4条为外源性蛋白，仅仅一条为内源性蛋白。

 

      综上所述，质谱技术现今已成为抗原表位研究领域必不可少的工具。随着质谱新技术的不断发展,质谱检测灵敏度以及检测限将不断提高，蛋白质测序长度也将不断延长，这一切必将会在抗原表位研究领域乃至在整个蛋白质研究领域发挥更大的作用。

 

参考文献 [1]McLafferty F W,Fridriksson E K,Horn D M,Lewis M A,Zubarev R A. Techview: biochemistry. Biomolecule mass spectrometry.[J]. Science,1999,284(5418). [2]郭爱林. 肝癌抗原肽的分离、纯化、鉴定及抗原肽疫苗的研究[D].第四军医大学,2001. [3] Hunt DF,Henderson R,Shabanowitz J. Characterization of peptides bound to the class I MHC molecule HLA-A2.1 by mass spectrometry.[J]. Science,1992,255(5049):1261. [4] Chicz, R. M. et al. Predominant naturally processed peptides bound to HLA-DR1 are derived from MHC-related molecules and are heterogeneous in size[J]. Nature,358(6389), 764-768