2018年10月3日，瑞典皇家科学院在斯德哥尔摩宣布，决定将2018年诺贝尔化学奖的一半授予美国科学家Frances H. Arnold的“酶的定向进化”，而另一半则同时授予美国科学家George P. Smith和英国科学家Gregory P. Winter，表彰他们在噬菌体展示技术研究中的突出贡献。这个技术到底是什么呢？是不是高冷到离大众很远呢？并不。以下我就来简单介绍一下噬菌体展示技术的基本原理及其应用吧。

 

 

图1 （来源：The official website of the Nobel Prize）

 

（1）噬菌体展示技术的基本原理

 

       谈到噬菌体展示技术的原理，或许你首先会问的第一个问题是：什么是噬菌体？噬菌体是一种病毒，是一种必须通过感染细菌、真菌等微生物，“盗取”这些微生物的营养物质，才得以繁衍下一代的病毒，因为部分噬菌体会导致被感染的微生物裂解，因此才获得了“噬菌体”的美名。生活中的噬菌体常见于细菌群落较多的地方，例如泥土或者动物的肠道之中。由于噬菌体具有结构简单，培养方便和繁殖较快等优点，因此在生物学实验室中得到广泛的应用。美国科学家George P. Smith发现在噬菌体的基因序列中插入一段外源的基因之后，不但不影响其生长状态与感染效率，并且该插入基因表达的外源蛋白还能被带到噬菌体表面，1985年史密斯先生发表了他发现的该项技术，并将其称之为噬菌体展示技术。^[1]

 

       噬菌体展示技术的原理其实并不难理解，如图2所示，科学家们将外源的目标多肽或蛋白的基因片段（红色的基因片段）插入到噬菌体的结构基因（噬菌体内灰色的基因片段）的适当位置上，在不影响噬菌体其他外壳蛋白正常表达并且功能不发生改变的情况下，使外源的多肽或蛋白与噬菌体的外壳蛋白进行融合表达，融合的蛋白分子会随着子代噬菌体的重新组装而被展示在噬菌体表面。这些被展示在噬菌体表面的多肽或蛋白分子仍然保持其该有的生物活性，并且具有相对独立的空间结构，进而能够被靶分子识别与结合。

 

       举个简单的例子，就像果农们在一棵桃树上嫁接上李子树的枝条后，这一棵桃子树上就能既长出来桃子，同时也能长出来李子。噬菌体展示技术也是相似的道理，它使得噬菌体既能“长出”自身原有的蛋白，同时也能“长出”我们所需要的其他“果实”，只不过这一技术是从基因水平开始下手的。

 

 

 

 

图2

 

 

 

       要从噬菌体文库中挑选中我们想要的噬菌体，也就是表达了目标分子的噬菌体，就要经过筛选的过程，该过程被称之为“淘筛”。该过程简单地说就是被展示在噬菌体表面的肽库或者蛋白库能够特异地与目标抗原识别并结合，经过足够时间的孵育之后，可使用洗涤液洗去与抗原结合较弱或者未结合的游离噬菌体。随后用酸碱洗脱液将特异性结合的目标噬菌体洗脱下来，接着再用中和后的噬菌体感染宿主大肠杆菌并进行扩增以得到下一轮的子噬菌体库。随后经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”富集过程后，能够与抗原特异性结合的噬菌体的比例得到了逐步提高。最终获得能够识别靶分子的多肽或者蛋白，可被用于后续的实验。

 

       这个过程我们按照图3可以将其这样理解：比如说我们所需要的目标是一个表达了“一个圆球”的噬菌体颗粒（我们的抗原是一个“凹半圆形”的分子，他们是刚好可以相互嵌合的），当我们第一次将其放在一起的时候，或许除了表达了“一个圆球”的噬菌体颗粒可以结合到抗原上之外，由于抗原有富余等原因，外型有点类似的表达了“两个圆球”的噬菌体颗粒也能结合上去。而表达“方形”的噬菌体颗粒由于不匹配则被洗涤液冲洗掉了。通过感染大肠杆菌进行扩增之后，该噬菌体库里面就仅含有了“一个圆球”和“两个圆球”两种噬菌体颗粒。进一步通过减少抗原的使用量的几轮反复过程之后，就可以富集到一个富含“一个圆球”的噬菌体颗粒的文库。从而可以挑选出了表达了我们所需的“果实”的噬菌体。

 

 

 

图3

 

（2） 噬菌体展示技术的应用

 

       日趋成熟的噬菌体展示技术凭借其具有高效、方便、灵活筛选等自身优势，目前已被应用于多个方面。例如，抗原表位分析、抗体制备、多肽药物制备、疫苗制备以及疾病诊断与治疗等，表1展示了噬菌体展示技术的部分应用实例。

 

 

 

表1 噬菌体展示技术的部分应用实例 ^[2]

应用方向	应用实例
抗原表位分析	囊尾蚴模拟表位
治疗性抗体的研发	阿达木单抗
抗体亲和力成熟	抗P24抗体
多肽药物制备	艾卡拉肽
疫苗研发 酶蛋白定向进化	抗幽门螺杆菌疫苗 耐热性的反转录酶

 

 

 

       噬菌体展示技术在癌症、自身免疫病的诊断及治疗领域中备受关注，发挥着重要的作用。谈到噬菌体展示技术在单克隆抗体方面的应用，不得不提的是第一款由噬菌体展示技术带来的药物： Adalimumab（阿达木单抗），商品名为Humira。Humira的研发是生物医药历史上的一大突破。上世纪80年代初澳大利亚的免疫学家Marc Feldmann教授在研究甲亢的时候，意外发现了IL-1（白细胞介素1）是类风湿性关节炎的潜在病因，并且发现作用于TNF-α（肿瘤坏死因子-α）的抗体几乎可以完全抑制IL-1的产生。但是他们当时获得的该抗体是来自于小鼠，鼠源的抗体在进入人体内后，会产生免疫反应，有潜在的副作用，就此该项研究到了瓶颈阶段。随后Gregory P. Winter教授通过噬菌体展示技术对TNF-α的鼠源抗体进行改造，经过多次优化之后得到了完全人源化的抗体，也就是我们所知道的阿达木单抗。该抗体自从2002年美国FDA批准上市以来，已经先后在全球超过100个国家和地区获批上市，被用于治疗包括类风湿性关节炎、强制性脊柱炎和银屑病等15种不同的适应症，为全球患者带来了福音。据艾伯维官方数据显示，2018年修美乐销售额为199.36亿美元，连续7年雄踞全球药品销售榜首，享有全球“药王”之称。即使是目前在肿瘤治疗领域中如日中天的PD-1单抗Keytruda也难以望其项背。随着噬菌体展示技术的深入研发与完善，相信其必在医药健康领域中发挥重要的作用。

 

 

 

 

 

参考文献

 

 

 

1.       G. P. Smith, Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228, 1315-1317 (1985); published online Epub Jun 14

 

2.  曲戈，2018诺贝尔化学奖：酶定向进化与噬菌体展示技术，生物学杂志。