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适配体:一种好用的分子识别工具

作者:香雪生命科学-翁志明

发布时间:2023-08-31

阅读:11742

 

       适配体(aptamer)这个术语源自拉丁文"aptus"(适合)和"meros"(部分),意为适合特定目标的分子片段。适配体是一段长度为15-100个核苷酸的寡核苷酸序列,能够高亲和性结合特定的目标分子。自从1990年筛选适配体的技术公布以来,随后的研究扩展了适配体的范围,不仅包括RNA适配体,还包括DNA适配体。适配体已经在环境监测、食品安全、临床诊断和疾病治疗等领域展现出广泛的应用潜力。本文将对适配体的类型、结构和性质、适配体的筛选方法、适配体的应用等方面进行简要的介绍。

 

适配体的类型

 

       适配体也称为核酸适配体,最常使用的是单链DNA和RNA这两种类型。单链DNA适配体具有高度灵活性,能够通过形成二级或三级结构与目标分子相互作用,实现高度特异的识别和结合。而RNA适配体具有更强的结构多样性和功能多样性,在某些情况下可能更具优势。双链DNA适配体则相对较少使用,只在某些特定情况下仍具有应用价值。研究人员会根据实验需求和目标分子的性质选择最适合的核酸适配体类型,以实现最佳的结合和识别性能。

 

适配体的结构和性质

 

      适配体与各种靶分子(小分子、蛋白质、细胞等)结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性,它可以通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠,形成一些稳定的三维空间结构。

 

       具体来说,适配体可以形成以下几种常见的结构:

 

       二级结构包括单链结构和部分双链结构。①单链结构:适配体大部分是单链的DNA或RNA,它可以呈现线性的单链结构。单链结构中的碱基序列按照从5'端到3'端的顺序排列。②部分双链结构:适配体的一部分序列可能会通过碱基互补配对形成部分双链结构,其中部分区域的碱基会相互配对,而其他区域则保持单链结构。

 

       三级结构包括簇状结构和伸展结构。①簇状结构:适配体的部分或全部区域可能会通过内部碱基间的氢键和其他相互作用力形成簇状结构。这些结构通常是非常短的局部结构,例如发夹状结构(hairpin loop)和内环结构(internal loop)。②伸展结构:某些适配体可以形成更复杂的伸展结构,例如茎环结构(stem-loop)和多分支结构(multibranch loop)。这些结构通常由碱基间的配对和G-四链体(G-quadruplex)等相互作用形成。

 

       适配体的二级结构和三级结构是动态的,并且可以在不同条件下发生结构的变化。这种结构的灵活性和可变性是适配体在识别和与其他分子相互作用时的关键特性。

       适配体被称为“化学抗体”。和传统抗体相比,适配体具有以下优势:①靶分子范围更广,可以是重金属、有机染料、氨基酸、抗生素、维生素、蛋白质、多糖,甚至是细胞、致病菌、病毒、组织等。而传统抗体的靶标一般是具有免疫原性的大分子。②分子量更小(15-30 kD)。③免疫原性更低、毒性更小。④组织渗透性更强。⑤通过化学合成,生产成本更低。

 

适配体的筛选方法

 

      适配体通过指数级富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,简称SELEX)来筛选获得。SELEX技术最早是由Craig Tuerk和Larry Gold在1990年8月发表在Sciense期刊上的文章公布出来,他们以T4 DNA聚合酶作为目标分子,并通过多轮的选择、放大和分离步骤,逐步筛选出对T4 DNA聚合酶具有高亲和力和特异性的RNA适配体。

 

       作为筛选适配体的一种实验方法,SELEX技术一般包括以下五个步骤:

 

①库的构建:SELEX的第一步是构建一个包含大量随机序列的DNA或RNA库。这个库通常由长度为15-100个核苷酸的随机序列片段组成,其中每个位置上的碱基都是随机的。这些随机序列片段通常被合成为寡核苷酸,并通过连接适当的引物序列来方便后续的PCR扩增。库的容量一般介于1013-1016。

 

②选择步骤:选择步骤是适配体的筛选过程,它通过与目标分子的结合来富集具有高亲和力的适配体。这个过程通常包括以下几个步骤:a.结合:将随机序列库与目标分子(如小分子化合物、蛋白质等)进行反应,特异性的核酸片段会结合目标分子。b.分离:通过适当的方法(如凝胶电泳、柱层析等)将特异性结合的核酸片段与未结合的片段分离。c.放大:将分离的核酸片段进行PCR扩增,以增加其数量。

 

③反复迭代:经过第二步的选择步骤后,得到的核酸片段被重新引入到下一轮选择步骤中进行进一步的筛选。这个过程通过多轮的结合、分离和放大(6-20次连续循环)来逐渐富集具有更高亲和力的适配体。每一轮选择的条件可以根据需要进行调整,以获得更好的筛选效果。

 

④高亲和力筛选和序列分析:经过多轮迭代后,进行最终的高亲和力筛选。在此阶段,可以采用更严格的筛选条件来筛选具有最强结合能力的适配体。选定的适配体经过测序分析以后确定其序列。

 

⑤适配体的验证和应用:选定的适配体需要进行进一步的验证,确认其对目标分子的特异性结合和亲和力。可以使用表面等离子共振(SPR)、生物层干涉 (BLI) 、流式细胞分析等技术进行验证。一旦验证成功,适配体就可以在不同的应用领域中使用,如生物传感、药物递送、疾病诊断和治疗等。

 

       在传统SELEX技术的基础上,研究人员根据不同的靶标对SELEX技术进行了优化:筛选小分子的方法主要有硝酸纤维素膜过滤法、亲和层析法等;筛选蛋白质、多糖等大分子的方法有毛细管电泳SELEX、光敏SELEX、亲和层析法、磁珠分离法、高速离心法等;筛选病原菌和细胞的方法有细胞SELEX。这些优化的SELEX技术显著提高了适配体的筛选效率。

 

适配体的应用

 

       适配体可以与各种靶分子(小分子、大分子、细胞等)实现高度特异性和高亲和性(平衡解离常数KD值介于nM-pM之间)的结合。将适配体与适当的传感器或信号放大系统结合,可以实现对目标分子高灵敏度的检测和分析。适配体在环境监测、食品安全、临床诊断和疾病治疗等方面具有广泛的应用潜力。

 

环境监测

 

       水质和土壤监测:通过选择与特定的水污染物、土壤中的有害物质(如重金属、农药、有机物等)结合的适配体,可以实现对水样和土壤中目标物质的高灵敏度和选择性检测。

 

       大气污染监测:适配体可用于检测空气中的有害气体或颗粒物。例如,适配体可以与挥发性有机化合物(VOCs)或细颗粒物(PM2.5、PM10等)结合,从而实现对空气质量的监测和分析。

 

食品安全

 

       食品中有害物质检测:适配体可以用于检测食品中的有害物质,如重金属、农药、毒素等。通过选择与目标物质结合的适配体,可以实现对食品中有害物质的高灵敏和选择性检测。

 

       食品质量监测:适配体可以用于检测食品中的营养成分、添加剂或其他关键指标,从而实现食品质量的监测和评估。

 

临床诊断

 

       适配体可以用于检测特定的生物标志物,如肿瘤标志物、病原体蛋白或细胞表面受体等。适配体的高度选择性和亲和性使其能够实现对这些标志物的灵敏检测,并可以与传感器或检测平台结合,构建出高效、准确的诊断工具。

 

疾病治疗

 

        通过筛选疾病相关特定靶分子的适配体,有可能作为运载工具或者直接作为药物来治疗相关的疾病。目前已有多种疾病相关的适配体被筛选出来,涉及到脉络增生血管、血管内血栓、急性冠状综合症、血管瘤、骨髓性白血病、肾癌、骨骼肌疾病、病毒感染(人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、乙肝病毒(HBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、新冠病毒(SARS-CoV-2))等。

 

        在肿瘤的治疗方面,通过选择与肿瘤细胞表面分子(如受体)结合的适配体,可以实现对肿瘤细胞的特异性识别和定位。适配体可以被用作靶向药物的运载工具,将抗癌药物精确地递送到肿瘤细胞,并减少对正常细胞的损害。适配体也可以像抗CTLA-4抗体和抗PD-1/PD-L1抗体那样作为免疫检查点抑制剂,通过结合到免疫检查点分子上,适配体可以干扰肿瘤细胞与免疫细胞之间的抑制性信号传导,从而恢复免疫细胞对肿瘤的攻击能力。

 

        适配体通过临床试验以后可以申请上市来治疗相关的疾病。2004年12月17日,FDA批准了注射剂Macugen用于治疗新生血管性(湿性)年龄相关性黄斑变性(AMD)。Macugen是一款聚乙二醇化的修饰性寡核苷酸药物,能够靶向结合血管内皮生长因子(VEGF165亚型),阻止异常血管形成并减少黄斑变性的进展。给药方式为玻璃体内注射。Macugen是第一款治疗AMD的药物,它的上市是适配体应用的一个重要里程碑。但遗憾的是,后来疗效更好的抗体药物Lucentis (Ranibizumab)上市以后,Macugen最终黯然退市了。这么多年过去了,目前适配体药物的临床试验也寥寥无几,数量远远比不上抗体。反映出适配体作为药物在治疗疾病方面,可能存在一些难点,还需要对适配体的选择、亲和性和稳定性等方面做进一步的研究和开发。

 

结论和展望

 

       经过三十多年的发展,适配体已经成为除抗体以外的另外一种好用的分子识别工具。它们和各种靶分子的特异性识别和高亲和性的结合能力为研究人员提供了丰富的资源和工具。适配体已经在环境监测、食品安全、临床诊断和疾病治疗等方面具有广泛的应用潜力。虽然目前适配体实际的应用情况、临床转化等方面和抗体相比差距很大,但我们仍然相信随着技术的改进和创新,适配体应该有机会获得更多的应用。

 

参考文献:

1. Craig Tuerk, Larry Gold. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science, 1990, 249(4968): 505-510.

2. Shuanghui Yang, Huan Li, Ling Xu, et al. Oligonucleotide Aptamer-Mediated Precision Therapy of Hematological Malignancies. Molecular Therapy: Nucleic Acids, 2018, 13: 164-175.

3. Jing Han, Liang Gao, Jinsheng Wang, Jia Wang. Application and development of aptamer in cancer: from clinical diagnosis to cancer therapy. Journal of Cancer, 2020, 11(23): 6902-6915.

4. Shuming Sun, Han Liu, Yan Hu, et al. Selection and identification of a novel ssDNA aptamer targeting human skeletal muscle. Bioactive Materials. 2023, 20: 166-178.

5. Tomasz Wandtke, Ewelina Wedrowska, Marcin Szczur, et al. Aptamers—Diagnostic and Therapeutic Solution in SARS-CoV-2. International Journal of Molecular Sciences. 2022, 23, 1412.

6. Yang Zhang, Mario Juhas, Chun Kit Kwok. Aptamers targeting SARS-COV-2: a promising tool to fight against COVID-19. Trends in Biotechnology, 2023, 41(4): 528-544.

7. 王周平, 张维潇. 适配体及其研究进展. 食品与生物技术学报, 2013, 32(9): 897-906.

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