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新型冠状病毒常规实验室检测技术

作者:香雪精准医疗--张婷婷

发布时间:2020-06-23

阅读:104

 

 

       新型冠状病毒感染导致的新型冠状病毒肺炎疫情在数月内蔓延全球,是当前全球最为关注的公共健康问题。截至2020年6月,全球累计确诊人数超过700万人,累计死亡人数超四十万。相比于2003年的爆发的SARS新冠病毒的传染性更强,在老年人和患基础病人群中的带来的危害更大[1]。2020年2月11日,国际病毒分类委员会将该病毒正式命名为严重急性呼吸道综合征冠状病毒-2(severe acute respiratory syndrome,SARS⁃CoV⁃2),同日世界卫生组织(WHO)将该病毒所引起的疾病命名为新型冠状病毒肺炎(corona virus disease⁃19,COVID⁃19)。

 

       根据基因组分析,SARS⁃CoV⁃2 和SARS同属于β冠状病毒属,属于可感染人类的并可引起疾病的冠状病毒。SARS⁃CoV⁃2结构上是一种球形、有包膜的正链单股RNA 病毒。COVID-19 具有人群普遍易感性,传染源主要为患者和无症状的感染者,飞沫和密切接触为主要的传播途径,潜伏期 1~14天,多为 3~7天。因此建立高效、快速、准确的实验室诊断方法对新冠肺炎早发现、早防控、早治疗都极其重要。

 

       目前最常用的实验室快速检测确定病原体的方法主要有两大类:基于遗传物质(DNA 或 RNA)的核酸检测和基于免疫反应的蛋白(抗体)检测。核酸是病毒的遗传物质,可选择特异性的核酸序列进行检测即可确定病原体。而病毒作为抗原可激发人体免疫反应从而产生抗体,抗原抗体特异性结合可作为检测确定病原体的第二类方法。

 

1 核酸检测方法

 

1.1 基因测序技术

 

       众所周知,基因组测序早已被的用于未知病毒的鉴定,该方法有助于我们更快,更全面的认识病毒了解病毒。病原体的基因组测序是目前最精确的检测方法,同时还可以监测病毒是否发生变异[4]。COVID-19爆发以来,中国疾控中心在短时间内就从患者体内分离出病原体,通过测序技术确定了其基因序列,已于2020年1月12日向世卫组织提供。同时我国发现SARS⁃CoV⁃2与SARS-CoV 的核苷酸同源性约为80%。基因测序技术最大的优势在于其极高的准确性,适用于初期病毒的鉴定和后期病毒的研究,但是其仪器要求配置高,测序时间长,导致其难以实现大规模的筛查。

 

1.2 实时荧光RT-PCR

 

       在第七版试行新型冠状病毒肺炎诊疗方案中,将实时荧光RT-PCR检测技术定为疑似病例确诊的标准之一,当有临床症状和影像学指征的疑似病例具备实时荧光RT-PCR检测新冠状病毒核酸阳性即可确定为确诊病例。实时荧光 PCR与普通 PCR区别在于反应体系中加入了荧光化学物质,通过检测最终荧光信号的强弱对目的基因进行相对定量。根据SARS-CoV-2的全基因组序列,国家卫健委推荐新冠病毒的三个特异性区域(ORF1ab基因、N基因和E基因)作为PCR扩增区域[5]。实时荧光RT-PCR法具有高灵敏度,高特异性,适用样本广泛的优势,但是其涉及的实验步骤多,检测阈值受限等多方面的影响,导致其会出现假阴性的结果。

 

1.3 基因编辑技术

 

      近年来,以CRISPR/Cas系统为代表的基因编辑技术在各个研究领域广泛应用,基于CRISPR的SHERLOCK技术的核心是Cas13a蛋白酶和与其结合的向导RNA。根据新冠病毒的RNA序列,设计出能够靶向新冠病毒特异性序列的向导RNA,当待测样本中存在新冠病毒的RNA时,向导RNA即可精准的识别该特异性RNA,并同时激活与其结合的Cas13a蛋白酶,Cas13a转入激活状态后可无区分的切割RNA分子。据此设计出和RNA相连的报告分子,当Cas13a得到激活,报告分子上的RNA就会被切断,当报告分子被切割时会释放可检测的荧光信号。在COVID-19 疫情暴发后,张峰团队针对SARS⁃CoV⁃2 基因组中ORF1 ab 和 S蛋白基因分别设计出特异性向导 RNA,实现了基于 CRISPR / Cas系统的SARS⁃CoV⁃2 检测。CRISPR / Cas检测方法无需大型仪器设备支持、操作简便、灵敏度高和结果可视化,应用前景广阔。

 

1.4 恒温扩增技术

 

       恒温扩增技术即利用引物、脱氧核糖核苷三磷酸、模板 DNA 及各种酶,在恒定温度下进行扩增[6] 。其中逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop -mediated isothermal amplification, RT-LAMP)是针对靶基因上的多个区域设计多条引物,在60~65℃的恒温条件下一步进行 RNA 逆转录和核酸扩增的方法。RT-LAMP具有易于操作、快速及特异性高等优势,可作为一种快速筛查的检测手段。但由于RT-LAMP的敏感性较高,极易受到污染而产生假阳性结果,故要严防操作污染。另外,当病毒载量低于RT-LAMP检测下线时,可能引起假阴性的结果。

 

2 蛋白检测方法

 

       由于SARS⁃CoV⁃2的遗传物质为RNA,而RNA具有高突变率和不稳定性,因此开发基于病毒蛋白的诊断和检测技术十分必要。SARS⁃CoV⁃2有四种种主要的结构蛋白,分别为刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白、膜(E)蛋白和核衣壳(N)蛋白,这些蛋白包括多个抗原表位,我们可以依据这些表位来制备对应的抗体检测病毒的存在,但制备抗原抗体耗费周期长。病毒在感染人体后会产生相应的特异性抗体IgM和IgG,IgM抗体为机体最早产生的抗体,产生快,消失快,可作为早期感染的指标,适用于早期诊断。IgG晚于IgM产生,具有产生晚、消失慢的特点,可作为感染和既往感染的指标。因此我们可以通过检测特异性抗体来证明病毒的存在。在第七版试行新型冠状病毒肺炎诊疗方案中,新增了 COVID-19特异性免疫球蛋白抗体检测以辅助确诊。

 

2.1化学发光法

 

       化学发光法是利用纳米磁珠标记病毒的重组蛋白捕获血液样本中的病毒抗体IgM或者IgG抗体,利用与吖啶酯(吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质)偶联的二抗识别抗体,加入激发液后,通过相对发光强度测定靶物质的量。纳米磁珠具有较大的比表面积,便于操作可快速富集样本中的血清抗体。化学发光法检测的主要优点包括采样方便,操作简单、检测时间短、成本低,适用于早

 

2.2胶体金免疫层析法

 

       胶体金免疫层析技术是以胶体金作为示踪标记物的一种新型免疫标记技术。 其主要是利用胶体金颗粒通过静电作用可与蛋白质分子结合的特点,将胶体金颗粒标记到SRAS⁃CoV⁃2重组抗原上作为免疫标记探针,当待测样品经过检测试纸的层析作用后,如含有待测新冠抗体则可通过胶体金颗粒固定到检测带上,从而产生显色条带 [7] 。SRAS⁃CoV⁃2抗体胶体金检测试剂盒,目前多用于体外定性检测人血液样本中的 SRAS⁃CoV⁃2 抗体(IgM/IgG),可在 10~15 min 得到检测结果,为大规模人群复工、复学等提供快速、便捷的现场检测手段。该方法操作方便,无需仪器设备,检测时间短的优势,然而该方法仅能定性检测,其检测灵敏度和特异性较低。

 

2.3酶联免疫法

 

       酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法是将SARS-CoV-2抗原固定到载体上,捕获人血清中的SARS-CoV-2的IgM/IgG抗体,再结合酶标记的抗IgM/IgG二抗抗体,利用酶与底物的显色反应对待测物进行定性和定量检测方法。ELISA 法具有特异性强,灵敏度高的特点,仪器配置要求低,但ELISA检测时间相对较长,对实验人员的操作技能和实验场所安全防护的要求更高。

 

      现阶段我国疫情已有效控制,但国外疫情发展的趋势不容乐观,在全球化背景下,对于传染性如此强大的疫病来说,控制情况决定于最慢最差的地区,各国正在积极合作共同抗役,各卫生机构、生物技术公司和仪器公司开发的检测试剂和平台略有不同,但都是围绕核酸和抗体进行检测。对于国内,我们目前首要的任务仍是精准防控,以防疫情的反弹,精准防控的关键则是精准诊断。目前,批准上市的新型冠状病毒肺炎检测试剂主要包括核酸检测试剂和抗体检测试剂两类。核酸检测是 COVID-19 辅助临床诊断主要的手段,但是该方法存在一定缺陷,主要是受样本采集储存运输、检测试剂质量以及实验者操作等因素的影响,导致在低度感染者的咽拭子中难以检测到病原体,从而影响确诊[8]和两次核酸检测阴性的出院患者会出现 “复阳” 的现象 [9]。因此我们辅助以血清抗体检测能可有效弥补核酸检测的不足。加强联合方法的应用,检测多个临床指标,可有效提高实验室检测结果的准确率。当前,在病毒检测试剂盒的产能满足临床需求的前提下,我们仍需技术创新,以提高新冠病毒检测技术的准确性、扩大筛查通量、缩短检测时间。

 

1、Phan T. Novel coronavirus: From discovery to clinical diagnostics.Infect Genet Evol, 2020, 79:104211

2、WU F, ZHAO S, YU B, CHEN Y M, WANG W, SONG Z G, et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China [J].Nature, 2020, 579: 265-269.

3、ZHOU P, YANG X L, WANG X G, HU B, ZHANG L, ZHANG W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin[J]. Nature, 2020, 579: 270-273.

4、CHEN L J, LIU W Y, ZHANG Q, et al. RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak[J] .Emerg Microbes Infect, 2020, 9 (1): 313-319

5、Chu D, Pan Y, Cheng S, et al. Molecular Diagnosis of a Novel Coronavirus (2019-nCoV) Causing an Outbreak of Pneumonia[J].Clin Chem, 2020, 66(4): 549-55.

6、王彦彬,诸靖宇,李瑞鹏,等。 实时荧光核酸恒温扩增技术在泌尿生殖道解脲脲原体感染中的应用[J]. 中。2016,26(23):5322-5324.

7、Zuo J Y, Jiao Y J,Zhu J,etal.Rapid Detection of Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus via Colloidal Gold Immunochromatography Assay[J].ACS Omega,2018,3(11):15399-15406.

8、WU J, LIU J, ZHAO X, et al. Clinical characteristics of imported cases of COVID-19 in Jiangsu Province: a multicenter descriptive study[J]. Clinical Infectious Diseases, 2020. DOI:10.1093/cid/ciaa199.

9、ZHANG J, WANG S, XUE Y. Fecal specimen diagnosis 2019 novel coronavirus-infected pneumonia[J]. Journal of Medical Virology, 2020. DOI: 10.1002/jmv.25742.

 

 

 

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