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PCR的前世今生——至敬凯利·穆利斯

作者:香雪生命科学研究中心-战凯

发布时间:2019-09-24

阅读:226

 

       今年8月7日,美国生物化学家凯利·穆利斯(Kary Banks Mullis)因肺炎去世,享年74岁。或许穆利斯这个名字并不像牛顿或者爱因斯坦那样为人所熟知,但他发明的PCR技术,至今在整个生物学乃至医学领域,都是最普遍最常用的基础研究手段。

 

       穆利斯于1944年12月生于美国北卡罗莱纳州,上世纪70年代,穆利斯在生物技术公司Cetus任职,并于1983年发明了PCR技术。1993年,因为发明PCR技术,穆利斯获得了诺贝尔化学奖。获奖后穆利斯曾说:“我是在从伯克利开车去门多西诺的途中想到的这一突破,在一条黑暗的路上,我灵光一闪解决了DNA化学中最令人头疼的问题。” 可以说,没有PCR技术,就没有现代分子生物学,是PCR技术彻底改变了生物化学、分子生物学、遗传学、医学、法医学等多学科的发展。《纽约时报》曾评价穆利斯的成就:“高度创新,非常重要。”那么什么是PCR,它又在现代生物医学领域发挥着怎样的作用呢?

 

1、什么是PCR

 

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术,简单点说,PCR就是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术,其最基本的特点是能将微量的DNA大幅增加以达到可以被检测的量,所以无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是影视剧中经常出现的几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,从而进行分析比对。

 

       操作PCR技术的仪器自1993年至今也已经历了四代产品:第一代是手动/机械手式水浴基因扩增 ,这或许是那个年代令很多分子生物学家痛并快乐着的一套设备,因为这阶段的PCR反应纯粹依赖人工,没有现成的仪器可用,三个水浴锅,三个计时器,还有不停在三个锅间倒换的样品……不仅劳动强度大,还容易因疲劳引起差错,但在那个年代,这已经是分子生物学研究领域的一项革新。第二代则是自动化控制型定性基因扩增仪,该仪器实现了全自动化高速准确的温度控制,满足PCR反应中变性,退火,延伸这三个步骤的快速变温需求,是至今使用最广泛的DNA扩增仪器,而后面的第三代、第四代都是以第二代扩增仪为基础,集成了荧光定量检测的元件,从而实现扩增过程的实时监控以及DNA拷贝数的计算。

 

2、PCR技术在现代生物医学领域的应用

 

在遗传病检测上的应用

 

       人类的遗传病,是指某一基因的碱基序列发生了突变,使之缺失或形成蛋白的不正常表达,从而引发机体病变。通过PCR技术结合限制片段长度多态性分析( PCR-RFLP),就可以从基因水平对遗传性疾病进行分析。这项技术目前已广泛应用于怀孕早期诊断,防止有遗传性疾病婴儿出生,有利于优生优育,提高人口质量,例如血友病,唐氏综合症,地中海贫血等疾病,目前都可以实现孕早期的筛查判断。

 

在肿瘤治疗领域的应用

 

       当今肿瘤治疗领域最热的一词便是“精准治疗”,而PCR技术的应用,则是精准治疗这一理念的基础。例如使用定量PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物用于早期诊断以及疗效评估。众所周知,卵巢癌是女性死亡率极高的恶性肿瘤,其潜伏期长又很难发觉,很少有患者能够在早期病变时被发现,大多数的患者诊断时都已扩散或转移,所以卵巢癌的早期诊断对于卵巢癌患者的治疗具有重要作用,而近些年研究发现,人附睾蛋白4(HE4)可能是一个鉴别卵巢良恶性病变的理想标志物,研究人员采用Real-Time PCR技术进行检测,发现晚期卵巢癌经过手术和治疗,在复发前几个月HE4便有升高迹象,这提示HE4或许可用于检测卵巢癌复发。类似HE4这样的例子不胜枚举,HER2,KARS,AFP等代表性的肿瘤标志物或突变基因,正在当今肿瘤治疗领域越来越多的受到关注。

 

在基因分型中的应用

 

       基于PCR技术衍生出的PCR-SSOP (PCR- sequence specific oligonucleotide polymorphism),已广泛应用于人类白细胞抗原( human leukocyte antigen,HLA)的分型检测。最现实的例子便是骨髓或器官移植,而在移植前首先必须进行组织配型工作,这其中至关重要的一环就是HLA分型的配对。如果捐受双方的遗传基因型相符合(尤其是HLA),那么接受器官的患者发生“排斥反应”的概率减小,移植的成功率也相对提高。当然,HLA的分型不仅仅可应用于器官移植,目前国际上备受推崇的肿瘤TCR-T免疫疗法,同样需要HLA分型数据的支持,我们都知道,TCR识别的是HLA-短肽的复合物,而不同的短肽又会有不同的HLA分型,比如目前国内TCR-T疗法的先驱广东香雪精准医疗有限公司已获批临床的产品TAEST16001,其靶点短肽的HLA分型为A0201,这就需要在收治病人时,通过上述手段进行病人的HLA分型检测,以此来判断该病人是否适合用TAEST16001进行救治。

 

       当然,PCR技术除了在上述几个主要领域的应用外,在临床上还有很多应用,比如检测病原体,包括患者是否受到某种病原体的感染,食物中各种病原体,病毒,细菌,寄生虫等的含量是否超标等等。

 

       曾经有学者认为,穆利斯的发明将生物学划分为了两个时代:PCR前时代和PCR后时代。我们有理由相信,在PCR后时代,我们可以依靠这项世纪发明,在生物医学领域取得更大的突破!

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